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小鼠肝脏基因组DNA的提取

                                      

实验五 小鼠肝脏基因组DNA的提取

 

l         实验目的

从新鲜的小鼠肝脏中提取基因组DNA，为southern杂交或DNA文库的构建做好准备。我们重点是要保证DNA的序列、产率和纯度，去除Dnase、机械剪切（对于如此之大的基因组，防止机械剪切是很重要的）、物理、化学因素的影响。

 

l        实验原理及过程

	实验步骤	实验原理
1	将饥饿一天的小鼠用脊髓脱臼法处死。	饥饿一天是为了减少肝中的糖原，以免在提取DNA时糖的去除有太多困难。（试剂CTBA可以去除糖原）
2	0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎	当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。 因为DNA并没有提出来，所以在这时重要的是防止DNA酶对基因组DNA的影响。
3	碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液，匀浆6次（冰上操作）。	只能匀浆6次。因为这一步只是将细胞分开，不是破碎细胞。若在此时破碎细胞，细胞中的DNA酶会降解基因组DNA。 低渗缓冲液破细胞，高渗缓冲液破组织。 冰上操做也是为了降低DNA酶的活性。
4	匀浆液转入2mL小指管，40C , 5000rpm离心2min。
5	沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀	破碎细胞。酶解液中含有蛋白酶K和SDS，这两种试剂不仅以温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性，又可以变性Dnase，还可以去除部分的蛋白。另外，还可以使核蛋白体从DNA上解离。（从以后的步骤开始，因为DNA酶已经被变性，而DNA也已尽被提出细胞，所以就要防止机械剪切对DNA的影响。）
6	550C 水浴酶解过夜，40C存放。
7	加RNase ,终浓度200ug/mL，370C保温60min。	RNase可以去除RNA，在这一部降解RNA，可以在后面的步骤中将核苷酸也提走。
8	加等体积酚/氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min。	异戊醇防止液体在振摇时起泡，并能抽提部分的糖；酚可以变性蛋白质并使其沉降；氯仿可以提取脂类，液体分层。 这里得酚是tris饱和酚，这样的酚饱和了水，不会抽提水层中的水，以致将DNA一并抽到有机层。Tris还可以起到调节PH稍微偏碱的作用。 这时蛋白质沉淀于两层之间（密度的原因）。 标记离心方向，因为沉淀有时看不见，而我们吸取液体是要从沉淀的反方向。 缓慢颠倒混匀是为了减小机械剪切。
9	40C，10000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清	因为肝脏中含有很多的酶（蛋白质），所以8，9步可重复一遍，效果较好。 用扩口枪头是为了减小机械剪切。
10	上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。	去除酚。
11	40C,10000rpm离心10min ，用扩口枪头取上清。	用扩口枪头是为了减小机械剪切。
12	上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇	脱水，因为液体中含有大量的盐（NaAc），使DNA沉淀下来，为丝状物。如果前面蛋白提取的不干净，会有弥散状的蛋白出现，应分清蛋白和DNA。
13	待DNA完全脱水而形成丝状物后，用扩口枪头吸出丝状物于另一离心管中。
14	丝状物用1mL 75%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心5min，弃上清。
15	超净台中稍干燥加 100uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存。	核基因组是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。
16	电泳：    0.3%琼脂糖凝胶 20mL(用TBE配)    4uLDNA + 4uLH2O + 1uL 10xloading + 1uL SYBR      80V 恒压电泳，凝胶成像仪观察和分析结果 基因组DNA的定量分析： 基因组DNA稀释200倍（用TE缓冲液稀释），总体积400Ul 测OD260 和 OD260 ／OD280	因为核基因组很大，所以用的胶的孔径要很大，浓度仅仅是0.3%。 测OD值为选做。

 

l         实验结果及分析

本次试验结果分析见下页（第二道是我的样品）

【作者: hghgblog】【访问统计:】【2005年05月14日 星期六 23:42】【注册】【打印】